Микроскопия ‒ оптимизация лабораторных исследований при выявлении фальсификатов

Цель микроскопического анализа – выявление фальсификатов

Микроскопия ‒ распознавание представленного на исследование образца, которое основано на том, что каждый вид сырья имеет свою специфическую макро- и микроструктуру, то есть строение и цвет внешних оболочек, различных включений, волокон и клеток.

Микроскопический анализ базируется на методических материалах Руководства по микроскопическому анализу кормовых продуктов (последнее, восьмое издание, 2018) Американской ассоциации кормовых микроскопистов (AAFM), образованной в 1955 году. Данное руководство признано и используется основными мировыми производителями комбикормовой продукции.

Микроскопическое исследование проводится комплексно с использованием двух микроскопов. Один микроскоп – стереоскопический, позволяющий объемно исследовать макроструктуру образца, в частности строение оболочек, в отраженном свете без приготовления препарата. Другой микроскоп – с приготовлением препарата, то есть исследование в тонком слое с применением предметного и покровного стекла, помогающий изучать микроструктуру образца на клеточном уровне по методу светлого поля и поляризации. В поляризованном свете растительные клетки и включения светятся, что дает возможность их идентифицировать: например, оксалаты калия оболочек сои светятся белым светом, а оксалаты калия оболочек люпина белого – красноватым.

Микроскопические исследования позволяют выявить в любом виде комбикормового сырья присутствие посторонних включений (подмесов) и идентифицировать их в количестве от 0,5% и выше. Кроме этого, в сырье растительного происхождения можно обнаружить наличие минеральной примеси, гифов микрогрибов и их спор, семян сорных растений с их видовым определением. 

Для сырья животного происхождения (мясо-костной муки) определяется приблизительный состав в процентах, то есть наличие костей, шкур, мышечных волокон (мяса), пера (со степенью гидролиза), кишечника с его содержимым, крови (кровяной муки).

Для рыбной муки определяется ее натуральность, то есть отсутствие посторонних включений, а также гифов микрогрибов. Для кормовых дрожжей ‒ вид дрожжей, наличие посторонних включений, повышающих белковый протеин, и приблизительное содержание в процентах добавленного кристаллического сульфата аммония или карбамида.

При микроскопическом анализе комбикормов определяется их приблизительный состав в процентах по макрокомпонентам растительного и животного происхождения, наличию известняковой муки, поваренной соли, премиксу, если его не менее 0,5%. Кроме этого, микроскопический анализ позволяет обнаружить в комбикормах и сырье присутствие муки из отходов кожевенного производства, которая является компонентом кумулятивного токсического действия, проявляющегося в снижении прироста сельскохозяйственных животных и птицы по мере накопления хрома в органах и тканях без внешних признаков токсикоза, токсичность которой не определяется экспресс-методами на инфузориях.

В моей 20-летней практике микроскопических исследований были случаи, когда вопрос об отказе от стартерного корма поросятам решался только микроскопическим исследованием, обнаружившим наличие семян сорных растений определенного вида в количестве около 2%, которые придавали комбикорму слегка горьковатый вяжущий привкус. 

Фальсификаты сырого протеина в комбикормовом сырье

Есть два пути создания фальсификатов. Один, самый малозатратный, – повышение или замещение протеина за счет введения небелкового азота. Другой путь, более затратный, – повышение или замещение протеина в кормовом продукте за счет введения другого высокобелкового продукта с более низкой ценой и, соответственно, более низкими кормовыми характеристиками. Бывает, что указанные пути пересекаются, при этом общее количество компонентов-фальсификаторов обычно не превышает 30% от массы всего продукта. 

В первом случае небелковый азот вводят в виде солей аммония ‒ карбамида (мочевины) или сульфата аммония. В пересчете по азоту включение 1% карбамида дает прибавку около 3% сырого протеина, а введение 1% сульфата аммония, соответственно, ‒ около 1% сырого протеина.

В настоящее время существует ГОСТ по определению содержания карбамида, в результате чего для фальсификации протеина чаще всего используют сульфат аммония. Он представляет собой бесцветные продолговатые кристаллы размером около 0,8 мм и менее. В комбикормах сульфат аммония встречается в количестве от 0,5% до 3%. Производители комбикормов нередко не подозревают, что он присутствует в их продукции, так как поступает в комбикорм с закупленным сырьем. Сульфат аммония может быть во всех видах комбикормового сырья. 

В фальсифицированных продуктах переработки сои, в основном сои полножирной экструдированной и соевом шроте, вводят горох или кукурузу как по отдельности, так и в совокупности. Иногда горох присутствует в количестве до 3%, но это не результат фальсификации, а итог засорения семенного материала сои горохом.

В фальсификатах глютена кукурузного сульфатом аммония доводят до соответствующих значений протеина низкопротеиновый кукурузный глютен, а иногда и глютеновый корм. Встречается импортный кукурузный глютен, в котором с глютеновым кормом содержится около 50% мелкокристаллического сульфата аммония с добавлением ярко-желтого красителя.

В фальсификатах кормовых аминокислот сульфат аммония обычно содержится в количестве 10‒25%. В лизин-хлориде с добавлением поваренной соли иногда достигает 40%, при этом кристаллы бывают крупные. В других аминокислотах ‒ метионине, треонине, триптофане ‒ кристаллы присутствуют в измельченном виде. Сульфат лизина не фальсифицируют сульфатом аммония, так как они существенно отличаются по структуре. В кормовых пивных дрожжах, выработанных на послеспиртовой зерновой барде, сульфат аммония присутствует в виде крупных и дробленых кристаллов в количестве, как правило, не превышающем 10%.

В связи с тем что по ГОСТу содержание небелкового протеина в пересчете на азот не должно превышать 10% (разница в значениях сырого протеина и протеина по Барнштейну), планку белкового протеина (протеина по Барнштейну) часто увеличивают вводом высокобелкового сырья ‒ кровяной и перьевой муки, кукурузного глютена, иногда муки из отходов кожевенного производства. Следует отметить, что дрожжи кормовые на послеспиртовой барде также производятся по ТУ и предназначены только для КРС, так как содержат до 40% сульфата аммония. В кормовых гидролизных дрожжах, выработанных на ЦБК, сульфат аммония не обнаруживался.

В практике фальсификации протеина встречается и карбамид, который выпускается в виде микрогранул диаметром около 0,8 мм и редко применяется даже в дробленом виде. Часто его вводят в виде насыщенных водных растворов при выпуске гранулированных шротов. В этом случае под микроскопом его обнаружить не удается. Но он легко вычисляется по несоответствию содержания сырого протеина и составу гранул. Так, например, если гранулированный подсолнечный шрот содержит большое количество лузги (при этом обычно гранулы имеют черный цвет), а присутствие сырого протеина около 38%, то его необходимо направить на определение наличия карбамида.

Высокопротеиновое сырье в практике фальсификации кормовых продуктов

Для фальсификации белкового протеина используют перьевую или куриную муку с высоким содержанием пера, кровяную муку, кукурузный глютен, муку из отходов кожевенного производства и люпин белый кормовой.

Перьевой мукой наиболее часто фальсифицируют рыбную, мясную и мясо-костную муку. Следует остановиться на степени гидролиза перьевой муки, которая легко распознается в поляризованном свете микроскопа: слабогидролизованная мука в нем светится, высокогидролизованная мука остается темной. Перевариваемость слабогидролизованной муки ниже, чем у высокогидролизованной, поэтому в некоторой степени она является неиспользованным протеиновым балластом, что необходимо учитывать. Нередко в мясо-костной муке, заявленной как свиная, присутствует до 25% перьевой муки. В рыбной муке ее содержание может достигать 20%, в ней также часто присутствует кровяная мука, которая легко определяется как добавленная: кровь рыбы включена в ее ткани.

Продукты переработки сои фальсифицируют люпином белым. В сое полножирной экструдированной и соевом шроте им замещают до 50% массы, при этом иногда частично освобождаются от оболочек люпина. Были случаи, когда экструдированный люпин и его шрот выдавали за продукты сои, так как сырой протеин у них практически не отличается, а он определяется в первую очередь. По всем остальным показателям люпин значительно уступает сое.

Мука из отходов кожевенного производства – самый опасный фальсификатор белкового протеина

Мука из остатков кожевенного производства действительно является отходом, который необходимо утилизировать, так как она содержит 2,5‒3,0% хрома (25 000 – 30 000 мг на 1 кг). В советские времена попытка ее дехромировать под лозунгом «Превратим отходы в доходы» оказалась экономически невыгодной, потому что цена дехромированной муки значительно выше высококачественной рыбной муки. Однако она до сих пор привлекает внимание потребителей, так как содержит около 80% высокоперевариваемого и, соответственно, высокоусвояемого протеина.

Мука из отходов кожевенного производства внешне бывает двух видов: одна – легкая, рыхлая серого цвета, другая – тяжелая, мелкозернистая темно-серого, почти черного цвета. По содержанию хрома они практически не отличаются. Как кормовой продукт она часто носит название «мука животного происхождения» или «белковая кормовая добавка» с заявленным протеином не менее 70% и перечнем всех качественных и химических характеристик, кроме хрома, который не определяется в комбикормовом сырье. Это произошло в результате того, что разработанный и утвержденный еще в 1987 году «Временный максимально допустимый уровень (МДУ) некоторых химических элементов и госсипола в кормах для сельскохозяйственных животных (мг/кг корма)» до сих пор не пересматривался, так как схож с европейскими нормами. Указанный МДУ включает 15 химических элементов, 10 из них являются металлами, в том числе хром. Обязательными к исследованию являются четыре элемента ‒ ртуть, кадмий, свинец и мышьяк. Хром не входит в этот перечень, однако его токсичность соответствует токсичности мышьяка: МДУ для хрома и мышьяка одинаков и составляет для комбикорма 1,0 мг на 1 кг корма.

Мука из отходов кожевенного производства встречается во всех видах сырья животного происхождения, а также в кормовых дрожжах. В рыбной и мясо-костной муке ее содержание доходит до 20%. В комбикормах наблюдалась в количествах от 0,5 до 3%. В малых объемах она, вероятно, поступала с фальсифицированным сырьем, а в количестве около 3% ‒ с вышеуказанной мукой животного происхождения или белковой кормовой добавкой. Необходимо отметить, что в практике микроскопических исследований мука из отходов кожевенного производства в комбикормовом сырье и комбикормах, особенно в СК, встречается и по сей день. Нынешнее положение может измениться только с поправками в законодательстве, при котором обязательным к исследованию в комбикормовом сырье кроме существующих четырех элементов станет еще и пятый – хром.

Чем коварна мука из отходов кожевенного производства? Тем, что она является токсикантом с кумулятивным эффектом. Присутствующий в ней хром, поступая в организм сельскохозяйственных животных и птицы вместе с кормом, срабатывает не сразу, а постепенно, накапливаясь в органах и тканях, оказывает токсическое действие, которое проявляется в значительном снижении среднесуточных привесов без внешних признаков токсикоза приблизительно через неделю вскармливания. Присутствие в комбикорме 1% муки из отходов кожевенного производства соответствует наличию в нем хрома в количестве около 300 мг/кг, то есть превышает максимально допустимый уровень содержания хрома в 300 раз.

Насколько это серьезно, покажем на примере. На одном из крупнейших свинокомплексов нашей страны, имеющем свое комбикормовое производство, 10 лет назад возникла проблема с привесами поросят. Все виды используемого сырья в комбикорме не показывали токсичность на инфузориях и были предоставлены на микроскопический анализ. Только в одном сырье – рыбной муке, которая вводилась в комбикорм в количестве 3%, была обнаружена мука из отходов кожевенного производства на уровне 20%. Таким образом, эта проблема появилась из-за присутствия хрома объемом 180 мг на 1 кг комбикорма. После такого случая все виды комбикормового сырья на свинокомплексе были поставлены на регулярный микроскопический анализ. Обладая кумулятивным токсическим действием, мука из отходов кожевенного производства не проявляет токсичность при ее определении экспресс-методами на инфузориях. Выживаемость инфузорий всегда составляла 90‒100 %.

Сразу возникает вопрос: можно ли вообще обнаружить токсичность присутствующих в комбикорме и сырье фальсификатов экспресс-методами на инфузориях? Да, можно, если это связано с наличием сульфата аммония или карбамида. Присутствие сульфата аммония в комбикормовом сырье в пределах 10% может вызвать гибель инфузорий за час. Сложнее с определением токсичности в комбикормах, где он содержится в количестве менее 3%. В этом случае определение общей токсичности надо проводить не при часовой экспозиции, как указано в пункте 4.1.3 изменения №1 к ГОСТу 31674-2012, при которой слабая токсичность не выявляется, а при двухчасовой экспозиции, как написано в пункте 4.4.4.3 того же изменения, при которой она может быть обнаружена. Важным условием для получения объективных результатов при определении общей токсичности является культивирование инфузорий до проведения анализа, которое должно производиться с фотопериодизмом, то есть смены дня и ночи, а не в полной темноте, как в термостате (ГОСТ 31674-2012, пункт 4.1.1 и 4.1.2.6).

Как влияет присутствие фальсификатов в комбикормах на животных? 

Если коротко, то отрицательно. Как известно, сульфат аммония и карбамид для моногастричных животных, а также телят младшего возраста и птицы является ядом. Однако все зависит от дозы, но слабый токсикоз и, как следствие, снижение прироста им обеспечены. Присутствие фальсификатов белковой природы, если они хранились в надлежащих условиях и не просрочены, могут привести к незначительному уменьшению прироста. Исключением является мука из отходов кожевенного производства, которая вызывает существенное сокращение прироста через неделю потребления комбикорма.

Фальсифицированный по протеину кормовой продукт отличается от оригинала худшими кормовыми характеристиками. Например, фальсифицированная на 50% белым кормовым люпином соя полножирная экструдированная приблизительно изменяет свой химический состав по содержанию: жира ‒ с 16,6% до 12,4%, сырой клетчатки ‒ с 7,0% до 10,2%, сокращение в протеине лизина, метионина и триптофана.

При фальсификации любого растительного сырья сульфатом аммония или карбамидом их присутствие можно выявить химическим анализом по наличию небелкового азота (протеина), который рассчитывается как разница между содержанием сырого протеина и протеина по Барнштейну. В растительном сырье не должно быть небелкового азота, и при отсутствии фальсификации обычно разница составляет менее 0,5%. Если в растительном сырье присутствуют нитраты и нитриты выше допустимых норм, то в пересчете на азот они входят в указанные 0,5%. Подобные примеры можно привести для каждого вида фальсифицированного комбикормового сырья.

Некоторые производители фальсификатов иногда пытаются доводить свои продукты до некоего совершенства, добавляя недостающий жир и прочее, но наличие введенного чужеродного белка можно определить ПЦР-анализом. В настоящее время посредством этого анализа можно приблизительно обнаружить, находится ли в следовом количестве данный белок, то есть он случайно занесен или присутствует в значительном количестве.

Микроскопический анализ комбикормов и комбикормового сырья считается субъективным анализом, так как  его результат зависит от знаний и опыта  микроскописта  (у автора он составляет  22 года).  Этот  анализ в нашей стране  не является гостированным,  но позволяет  дать нужные  направления  лабораторным испытаниям, сделать их минимальными  и в то же  время достаточными.